分享杂交瘤基因测序流程

源杭呐麻

1什么是杂交瘤测序
杂交瘤细胞抗体基因测序是指使用专业的兼并引物（degenerateprimer）和测序方案，同时化经济成本和时间成本，为客户提供速准确的抗体可变区域以及全长基因测序服务。

图1：杂交瘤测序

2杂交瘤测序目的
杂交瘤细胞在保存过程中存在抗体基因丢失、细胞状态不好影响抗体产生，甚至细胞死亡的情况，为将秀抗体长期保存、稳定生产，可将杂交瘤细胞中的抗体基因提取并测序，比较终拿到核苷酸序列，并以DNA形式保存，用于后期外源表达及生产。

3杂交瘤测序应用
杂交瘤细胞抗体测序所获取的杂交瘤细胞单克隆抗体基因序列，是发表文章或专利必须信息和重组表达工程抗体的前提之一，同时也是抗体人源化工作的基础。

4泰克生物能够为客户提供高质量的杂交瘤测序服务
标准周期单克隆抗体测序服务：抗体可变区VH和VL测序、抗体VH，VL和前导区测序、全抗体VH，VL，前导区和恒定区测序，3-4周完成测序服务。
速单克隆抗体测序服务：从目标细胞株速识别的抗体序列，可在10天内获得测序结果。

5泰克生物为客户提供杂交瘤测序服务的全流程介绍
泰克生物为客户提供杂交瘤测序服务，流程包括：RNA提取，cDNA克隆，T载体构建，抗体基因测序，生物信息学分析，项目报告。

图2：杂交瘤测序流程
51杂交瘤生产和总RNA提取
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从杂交瘤细胞中提取总RNA。
52反转录合成抗体可变区cDNA
521反转录
使用逆转录酶试剂盒，另外使用的是RNA样本（来自小鼠抗体的杂交瘤RNA样本或来自嵌合抗体RNA样本）、引物、10mM脱氧核苷酸磷酸混合物（dNTPs)、H2O和80UμLRNAse抑制剂。注意：由于其RNA含量，将模板转换寡核苷酸分装并储存在C80℃。
根据以下方案执行逆转录：在操作期间将所有反应保持在冰上。对于每个RNA样品，设置个cDNA合成反应：一个用于k脚本a链，一个用于lambda链，一个用于重链。理想情况下，每个抗体只会扩增一条轻链。


图3：3H4k脚本a和3H4lambda可变区的蛋白质序列比较

5211在PCR管中，准备Mix1：2μL50ngμLRNA、1μL10μM基于抗体链的反向RT引物（例如用于小鼠抗体的mIGKRT、mIGLRT或mIGHGRT）和1μL10mMdNTP。对于一个RNA样本，需要管Mix1，每管包含不同的反向引物。
5212在05mLEppendorf管中，配制Mix2：195μLH2O、2μL5xSMARTScribe缓冲液、1μL20mMDTT和03μL100μM模板转换寡核苷酸。为Mix2提供的体积用于一个cDNA合成反应，因此根据需要进行放大，即每个杂交瘤RNA样品制备Mix2体积的倍。为所有反应准备了Mix2的一种主混合物。
5213通过在热循环仪中将含有Mix1的试管在72℃下孵育3分钟，使RNA二级结构变性。
5214在Mix1变性期间，将以下物质添加到Mix2：每个cDNA合成反应025μL80UμLRNAse抑制剂和05μL100UμLSMARTScribe逆转录酶。
5215将6μLMix2添加到每管变性Mix1中。
5216在热循环仪中，合并的混合物在42℃下孵育60分钟，然后在70℃下孵育5分钟终止反应。反应保持在4℃。逆转录后立即进行PCR扩增。不需要cDNA纯化步骤。
522抗体可变区的PCR扩增
5221为每个cDNA合成设置PCR反应：10μL5xPCR缓冲液，1μL10mMdNTPs，3μLRT反应合成的cDNA，25μL10μM通用正向引物ISPCR，25μL10μM反向PCR引物在抗体链上（例如小鼠抗体的mIGKPCR、mIGLPCR或mIGHGPCR）、305μLH2O和05μL2UμLPhusion聚合酶（或其他高保真聚合酶）。
5222根据以下热循环仪条件进行降压降压PCR：98℃30秒；98℃15秒、63C575℃30秒（每个循环降低温度05℃）和72℃30秒的10个循环；98℃15秒、56℃30秒、72℃30秒15个循环；随后72℃7分钟；并保持在4℃。
5223每个RT-PCR反应取5μL在90V的TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上运行。扩增的小鼠抗体产物出现在550-600个碱基对之间。扩增的人抗体产物出现在750-850个碱基对之间。QuickLoadPurple2-LogDNALadder(NEB,N0550S)用作标准品。

图4：抗体可变区PCR扩增
53T载体构建
使用Macherey-Nagel的PCR清理和凝胶提取试剂盒对RT-PCR反应进行PCR清理。根据平末端克隆试剂盒手册，将2μL的每个PCR清洗的产物平末端克隆到pCR-Blunt-II-TOPO载体中。接下来，将每个TOPO克隆反应的3μL转化为化学感受态EColi。将每个转化的100μL涂布在含有50μgmL卡那霉素的LB平板上，并在37℃下孵育过夜。

54抗体基因测序
获得菌落后，将每条抗体链5-10个菌落接种在5mLLB卡那霉素培养基中，并在37℃下以250rpm摇动过夜。这些培养物使用Macherey-Nagel的小量制备试剂盒进行小量制备，所得质粒DNA由SequetechCorporation使用M13正向引物进行Sanger测序。

55生物信息学分析
使用GitHub上提供的自定义Python程序分析测序数据，去除非功能性的DNA。

56项目报告
交付得到的抗体序列。

杂交瘤细胞单抗基因序列的获取是进行重组抗体制备，抗体药开发的基础。泰克生物能够准确熟练地对多物种来源的杂交瘤细胞进行序列测定，服务包括小鼠杂交瘤细胞，大鼠杂交瘤细胞，兔杂交瘤细胞以及不同物种的重组单克隆抗体（通过噬菌体技术构建的单抗基因获得）等。通过严格的质量控制，以确保高准确度。



如果能实践这几点，抗体开发定能独树一帜，成为行业的佼佼者，并不断的前行着。泰克生物为客户提供基于M13噬菌体抗体展示系统的高亲和力、高特异性的抗体药物前期发现技术服务，为客户后续的CAR-T/CAR-NK先导序列设计、抗体人源化、药物靶点抗体开发、双特异性抗体开发以及高效阻断型中和抗体开发等下游研发工作提供有力支持。https://www.tekbiotech.com/